Hongos Micorrízicos. Protocolos de elaboración.

Hongos Micorrízicos. Protocolos de elaboración.

La prospección y selección de microorganismos, al igual que su mantenimiento y conservación, son requisitos indispensables para el trabajo con esta asociación simbiótica, dando siempre prioridad a las cepas propias del lugar.

Protocolos para la elaboración de inóculos micorrízicos.

El desarrollo de inóculos micorrízicos es un proceso biotecnológico complejo que requiere múltiples pasos. Los Hongos Micorrízicos Arbusculares (HMA) son simbiontes obligados y su cultivo siempre depende de una planta completa o de una raíz. Sin embargo, su elaboración constituye un reto biotecnológico interesante debido a los múltiples beneficios que se pueden obtener. En efecto, los HMA son beneficiosos para el desarrollo y la salud de las plantas, así como para la recuperación de suelos y la biorremediación. Esta última, unida a una mayor conciencia del cuidado del medioambiente y la biodiversidad, es una tecnología que se enmarca en las alternativas para el desarrollo de una agricultura sustentable que responda a la demanda de productos de calidad, libres de pesticidas y residuos de agroquímicos.

El aislamiento, la producción y el análisis de eficiencia de inóculos micorrízicos son procedimientos que requieren personal calificado, con conocimientos técnicos, y el manejo de metodologías apropiadas.

Como se mencionó anteriormente, la prospección y selección de microorganismos, al igual que su mantenimiento y conservación, son requisitos indispensables para el trabajo con esta asociación simbiótica, dando siempre prioridad a las cepas propias del lugar. En el caso de los HMA, al no ser posible su cultivo in vitro con técnicas tradicionales, el cultivo y la conservación se realiza en plantas trampa.

En Ecuador se ha trabajado muy poco en esta área. Muchos de los inóculos disponibles para comercialización son importados.

La producción de inóculos micorrízicos se realiza en contenedores o en suelos inoculados utilizando diferentes sustratos, en cultivos o plantas trampa.

Los inoculantes micorrízicos por lo general constan de un sustrato que contiene propágulos micorrízicos: fragmentos de raíz colonizada con HMA y fragmentos de micelio fúngico y/o esporas. Estas últimas son formas de resistencia.

Para la propagación del inoculante se recomienda utilizar plantas de crecimiento rápido y ciclo vegetativo corto que desarrollen un sistema radicular amplio, no sean exigentes en el riego y sean muy susceptibles a la colonización. Las que han demostrado buena micorrización son cereales, leguminosas, llantén y cebolla.

A partir de inóculos micorrízicos cuya eficiencia ha sido probada, se puede realizar la propagación con la metodología detallada a continuación. Se inicia con macetas pequeñas que servirán de inóculo para macetas cada vez más grandes y con mayor cantidad de semillas.

Propagación de inóculos micorrízicos.

Para la propagación de inóculos micorrízicos se requieren los siguientes materiales y procedimientos:

PROTOCOLO 1

  1. Materiales
  • Inóculo micorrízico.
  • Sustrato: lombricompuesto o tierra negra, pomina y cascarilla de arroz en proporción 2:1:1.
  • Semillas de gramíneas y de leguminosas.
  • Macetas de diferentes tamaños.
  • Fundas para cultivo de plantas en diferentes tamaños.
  1. Procedimiento
  • Llenar 3/4 de la maceta con el sustrato.
  • Colocar sobre el sustrato una capa fina del inóculo micorrízico.
  • Colocar sobre el inóculo 3–5 semillas de leguminosa y 3–5 semillas de gramínea.
  • Tapar las semillas con un poco de sustrato y regar.
  • Cuidar las plantas por 3–4 meses.
  • Cortar la parte aérea de las plantas trampa y suspender el riego 10–15 días antes de usar el inóculo. Al cabo de ese tiempo cortar las raíces de las plantas en pedazos de aproximadamente 1 cm y mezclarlos con el sustrato. Esto constituye el inóculo para el siguiente escalamiento, el mismo que está conformado por los propágulos de HMA: las raíces colonizadas, las esporas y el micelio que están en el sustrato.
  • Repetir los pasos 1 a 6 con macetas de mayor volumen, utilizando el inóculo obtenido en el paso anterior. Si es posible, cambiar de hospedero pero siempre combinando una leguminosa y una gramínea. Alternar las semillas utilizadas durante el proceso de escalamiento.
  1. Uso de inóculos micorrízicos

Hay que recordar que la asociación se establece durante el crecimiento activo de la planta por lo que se recomienda su uso de la siguiente manera:

  • Para semilleros mezclar el inóculo con el sustrato.
  • Añadir inoculante a cada maceta a razón de 15 g inóculo/kg.
  • Para plantas que se reproducen con estacas, el inóculo debe estar a la altura de la punta de la estaca.
  • Para plantas producidas por micropropagación o cultivo in vitro, inocular al momento del trasplante.

PROTOCOLO 2

A continuación, se describe el procedimiento para la fabricación de un inoculante propuesto por el Laboratorio de Rhizobiología del Centro de Investigación Agrícola Tropical (CIAT) de Santa Cruz:

  1. Preparación del manual de soporte.

En el momento del acopio la turba tiene aproximadamente un 50 % de humedad. Se la seca al aire hasta el 30 % extendiendo el material en una capa de 5–10 cm sobre el piso. Luego el material es desmenuzado en un molino de martillos y cernido en tamiz con aperturas de 0,5 mm de diámetro.

La materia prima tiene un pH de 4,3. En un medio tan ácido las bacterias mueren, por lo que es necesario neutralizar hasta 6,8–7,2 agregando Ca(OH)₂ en una relación del 3 % (peso hidróxido de calcio/turba seca) en una mezcladora de cemento de 300 litros. Para mejorar la homogeneización se añaden tres bolas de hierro (ø 9 cm).

Luego se humedece el soporte con agua de lluvia antes de proceder a la dosificación en bolsas de plástico autoclavable (polipropileno de 40 µm de espesor). Existen distintas formulaciones para las diferentes leguminosas. Se produce inoculante en bolsas de 350 g para soya, inoculante para alfalfa y fréjol en bolsas de 25 g e inoculante para otras especies en bolsas de 100 g. Un punto importante en la preparación es la esterilización del soporte. Se esterilizan lotes de 300 bolsas en autoclave de 500 litros a 121 °C por dos horas.

  1. Preparación de la bacteria
  2. Selección de la cepa

Se empieza con la selección de la cepa de Bradyrhizobium más eficaz para fijar el nitrógeno atmosférico. Para hacer las evaluaciones necesarias se debe contar con una colección de cepas microbianas procedentes de diferentes especies leguminosas. La selección de cepas se lleva a cabo en tres fases:

  • se estudia la infectividad de las cepas en sistemas estériles de solario;
  • se hace una evaluación de la fijación de nitrógeno en macetas en invernadero;
  • se hace una evaluación final de las cepas seleccionadas mediante ensayos de campo.
  1. Multiplicación de la bacteria

Se transfiere la cepa específica de su tubo de almacenamiento a un Erlenmeyer de 1 litro con 100 a 500 ml de medio nutritivo. Se coloca el Erlenmeyer en un agitador (100–150 rpm) para airear el medio nutritivo por 3 días (Rhizobium) o 5 días (Bradyrhizobium) a una temperatura de 30 a 35 °C. Durante este período crece una densa suspensión madre con una concentración de bacterias de alrededor de 10ⁱ⁰ células por ml en fermentadores con 30 litros de medio nutritivo.

  1. Impregnación del caldo

Cuando está aprobada la pureza del caldo Bradyrhizobium mediante tinción de Gram y las bolsas con soporte están listas (enfriadas después del autoclavado), se procede a la impregnación del caldo en el soporte. Cada bolsa es abastecida con 20 ml de caldo aumentando de esta manera la humedad final del producto hasta aproximadamente el 40 %. La alícuota es introducida en el soporte con una jeringa. Luego se sella el agujero con cinta adhesiva. El último paso del proceso es embolsar el inoculante N2 en el envase externo de polietileno de 60 µm de espesor. Este envase lleva la especificación del producto, las precauciones y el modo de aplicación. Se deja madurar el producto final a una temperatura de 25 a 30 °C durante 2–3 semanas. Finalmente se almacena en una cámara fría a 10 °C hasta el momento de uso.

  1. Control de calidad

Se remite al número de bacterias vivas específicas para el cultivo. Si bien este es un parámetro adecuado para indicar la calidad en una manera cuantitativa, no indica el grado de eficiencia de la cepa presente en el producto.

A manera de referente para determinar la calidad de un inoculante, en la tabla 13 se muestran los períodos de validez para la comercialización de un inoculante con base en el número de rhizobios vivos por gramo y las condiciones de almacenamiento, según la Resolución 208/90 del Ministerio de Agricultura de Bolivia.

 Hongos Micorrízicos

  1. Usos del inoculante

Para inocular la semilla se busca un lugar fresco en la sombra, pues los rayos solares son letales para el rhizobio. Se abre el envase justo antes de su uso. Generalmente se aplica el inoculante a la semilla a manera de barro. Primero se prepara la solución adherente, que usualmente es agua azucarada o agua con un adherente específico. Luego se suspende el contenido del envase adherente antes de mezclarlo con la semilla.

Encima de la semilla inoculada se puede aplicar una cobertura de polvo de calcita o roca fosfórica molida finamente (< 50 µm) para obtener semillas peletizadas. El adherente tiene un efecto favorable en la supervivencia de la bacteria en la semilla inoculada. Sin embargo, una vez inoculada la semilla, la bacteria presenta una alta tasa de mortalidad y por eso se debe sembrar lo más rápido posible. Es recomendable hacerlo dentro de las cuatro horas posteriores a la inoculación para lograr la introducción de un número suficiente de bacterias vivas en la tierra.

PROTOCOLO 3

  1. Aislamiento de Rhizobium desde nódulos de leguminosas.
  • Seleccionar una leguminosa de interés.
  • Separar los nódulos de la raíz y esterilizarlos (usando material totalmente estéril), para lo cual hay que seguir los siguientes pasos:
  • sumergir los nódulos en alcohol por 1 minuto,
  • sumergir los nódulos en cloretol por 3 minutos,
  • lavar los nódulos en agua destilada estéril 5 veces,
  • macerar los nódulos y obtener la suspensión bacteriana.
  • Con la ayuda de un asa de platino completamente estéril tomar una alícuota de la suspensión y raspar en el medio de cultivo sólido (YMA, Levadura Manitol Agar) contenido en cajas Petri.
  • Distribuir la suspensión de tal manera que a los 5 días se observen colonias separadas y puras.
  • Incubar a 28 °C por 5 días.
  • Tomar una colonia pura y pasar a medio de cultivo sólido en tubos para su almacenamiento. Paralelamente pasar a medio líquido y dejar crecer bajo agitación por 5 días hasta conseguir un crecimiento aproximado de 108–109 células por ml de cultivo (determinado utilizando cámara Petroff Hausser o soluciones McFarland).
  1. Medio de cultivo YMA

(Somasegaran & Hober 1994)

  • manitol: 10 g/l
  • K₂HPO₄: 0,5 g
  • MgSO₄.7H₂O: 0,2 g
  • NaCl: 0,1 g
  • extracto de levadura: 0,4 g
  • agar: 20 g
  • agua destilada: 1 litro

Puede usarse rojo congo (10 ml/litro de un stock de 0,25 g / 100 ml de agua destilada) o en su lugar azul de bromotimol (stock de 0,5 g/100 ml de etanol, colocar 5 ml/litro de YMA).

  1. Tinción de Gram de la suspensión bacteriana
  • Aplicar 20 gotas de una solución de cristal violeta al portaobjetos que contiene el “raspado” bacteriano (no muy concentrado). Esperar 1 minuto. Enjuagar con agua.
  • Cubrir con solución fresca de iodo por 1 minuto.
  • Decolorar gota por gota el “raspado” hasta que no se vea el colorante primario (5 segundos). El tiempo depende del grosor del raspado.
  • Enjuagar con agua por 3 segundos.
  • Contrateñir por 30 segundos con 2 % de agua, safranina O y enjuagar con agua (3 segundos).
  • Secar la placa al aire y examinar bajo microscopio (aceite).
  • Determinar el tipo de tinción.
  1. Tolerancia de Rhizobium a antibióticos y metales pesados
  • Diluir la suspensión de la cepa aislada de Rhizobium hasta 10⁸.
  • Pasar la bacteria a cajas (LMA) conteniendo 100-50-25-10-5-0 µg/ml de estreptomicina. Para esto colocar 20 µl de la dilución en cada caja Petri. Usar tres cajas por dilución.
  1. Resistencia a estreptomicina
  • Preparar 6 matraces Erlenmeyer con 300 ml (LMA) cada uno.
  • Autoclavar (dejar en baño María).
  • Preparar stock de estreptomicina (10 mg/ml), disolviendo 0,2 g de estreptomicina en 20 ml de agua destilada.
  1. Esterilización con filtro

Cuando el agar se enfríe (55 °C) colocar asépticamente 3 ml de la solución estéril de estreptomicina en el primer Erlenmeyer. Mezclar homogéneamente. Colocar en 10 cajas Petri. Marcar 100 µg/ml.

Repetir usando:

  • 1,50 ml de estreptomicina (marcar 50 µg/ml)
  • 0,75 ml de estreptomicina (marcar 25 µg/ml)
  • 0,30 ml de estreptomicina (marcar 10 µg/ml)
  • 150 µl de estreptomicina (marcar 5 µg/ml)

El procedimiento es el mismo para determinar la tolerancia a metales pesados:

  • concentración de aluminio: 500 µg/ml (AlCl₃.6H₂O)
  • cobre: 100 µg/ml (CuCl₂.2H₂O)
  • mercurio: 5 µg/ml (HgCl₂)
  • cadmio: 20 µg/ml (CdCl₂.2H₂O)
  • zinc: 100 µg/ml (ZnCl₂)
  • plomo: 500 µg/ml: (Pb(CH₃COO)₂)
Hongos Micorrízicos
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